液体活检，也称为液态活检或者液相活检，是指利用人体体液作为标本来源检测获取肿瘤相关信息的技术。目前，外周血是主要的检测来源，除了检测正常的红细胞、白细胞、来自正常细胞的游离DNA（cfDNA），还可以检测到一些来自肿瘤的物质，包括CTC、ctDNA、外泌体。液体活检是一种新兴的疾病诊断和监测工具，可应用于癌症、产前诊断、器官移植等一系列疾病。由于在众多应用场景中，液体活检在癌症领域的应用最为广泛，因此狭义的液体活检定义为针对肿瘤诊断与治疗领域。

▲液体活检样本来源概述

注：液体活检样本来源包括外周血（循环肿瘤细胞[CTC]、外泌体[Exonsomes，肿瘤细胞释放的膜包裹囊泡]，循环肿瘤DNA[ctDNA，由凋亡或坏死的肿瘤细胞释放]、脑脊液（Cerebrospinal fluid）、唾液（Saliva）、胸水（Pleural fluid）、腹水（Ascites）、粪便（Stool）、尿液（Urine）。

▲液体活检技术与其他早期诊断技术比较

▲液体活检发展历程

液体活检根据检测的生物标志物不同，可将液体活检技术分为ctDNA检测、CTC检测、外泌体检测。ctDNA检测主要指检测来自于外周血中的肿瘤细胞的片段化DNA片段，CTC检测主要指检测来自外周血中的肿瘤细胞，外泌体检测主要指检测来源于肿瘤细胞脱落的囊泡。

▲液体活检分类

循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是指从肿瘤原发或转移灶的肿瘤细胞上脱落下来、并释放到外周血液中的单链或双链 DNA 片段，长度通常为160~180bp。ctDNA 的来源主要有三种，即凋亡或坏死的肿瘤细胞、活的肿瘤细胞和 CTC。ctDNA最早在cfDNA中发现，cfDNA广泛存在于人体的体液中，包括外周血、尿液、唾液等，其中来自肿瘤细胞的cfDNA即为ctDNA。根据肿瘤患者的临床分期不同，ctDNA占cfDNA总量的0.16%~43%不等，1mL血液中约含0.08~38ng ctDNA。ctDNA的半衰期非常短，一般不超过1.5小时。

目前检测ctDNA的技术主要有 ：二代测序（NGS）、实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、扩增受阻突变系统聚合酶链反应（ARMS-PCR）、数字PCR（dPCR）[包括磁珠乳液扩增技术（BEAMing）和微滴式数字PCR（ddPCR）]，使用以上技术可以对ctDNA进行分析，从而了解病情进展，达到尽早诊断和治疗的目的。面对如此多的ctDNA检测技术，不同技术各有优劣，在《液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识》（以下简称“液体活检共识”）中关于ctDNA检测技术该如何选择达成2项共识。

▲ctDNA分离与分析

▲《液体活检共识》中关于ctDNA检测技术的选择

ctDNA和肿瘤的基因信息可保持高度的一致性，可提供患者的综合信息，具有损伤较小、易获得等优点，其在临床的诊疗和预后评估等方面都具有实际意义，因此，ctDNA作为液体活检的热点被广泛研究。《液体活检共识》指出ctDNA在早期辅助诊断、指导临床用药、预后提示、耐药机制探索等肿瘤临床实践中具有重要应用价值。

ctDNA检测在靶向药物伴随诊断中具有很大的优势，有助于确保药物安全性以及有效性。多项临床试验证实，液体活检技术灵敏度较高，其相应标志物往往在临床表现和影像学显示病变之前就能进行早期肿瘤筛查。

目前，已有多款基于ctDNA检测试剂盒被FDA/NMPA获批用于临床实际工作，主要分为两大类：一类是检测血浆等体液中特定基因的甲基化，用于特定肿瘤的辅助诊断或筛查。如：NMPA和FDA已相继批准了血浆SEPT9基因甲基化检测试剂，用于特定人群结直肠癌的辅助诊断。此外，NMPA目前批准了肺泡灌洗液中SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测，用于肺癌的辅助诊断等。一类是检测血浆中特定基因的突变情况，用于特定药物的伴随诊断。如：FDA和NMPA相继批准了非小细胞肺癌血浆中EGFR基因的突变检测，用于奥希替尼等靶向药物的伴随诊断。2020年8月7日，FDA批准了首个基于NGS的液体活检伴随诊断大panel产品Guardant360 CDx（Guardant Health）上市，可检测55个基因的变异信息，适用于泛实体瘤，并作为奥希替尼的伴随诊断。2020年8月26日，FDA又批准了第二个基于NGS的液体活检伴随诊断大panel产品FoundationOne Liquid CDx（F1LCDx，Foundation Medicine）上市，可检测324个基因的变异信息及与免疫治疗相关的生物标志物血液微卫星不稳定性（bMSI）和血液肿瘤突变负荷（bTMB），适用于泛实体瘤，并作为多个靶向药物的伴随诊断。

ctDNA包含患者的基因突变信息，不仅可对靶向药物的疗效进行预测，还可发现耐药后突变的基因。肿瘤耐药是目前治疗恶性肿瘤面临的主要问题之一，由于耐药机制复杂，利用ctDNA可以了解耐药突变的产生并寻找新的治疗靶点。纳入多个肿瘤活检或尸体解剖标本的研究表明，单个患者的不同转移部位经常共存多种独特的耐药性改变，但可以从单个血浆样本的cfDNA中共同检测到。

▲基于ctDNA监测耐药性和肿瘤异质性

目前对于肿瘤患者的预后评估与复发监测多采用传统影像学检查结合实验室检查的方法，与传统方法相比，ctDNA具有避免辐射、减少伤害的优点，同时更具有预见性，可提前数月发现肿瘤有无进展。ctDNA检测对于包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌在内的多种实体瘤进展具有重要预警价值，其丰度改变可早于影像学发现复发/转移灶。这意味着可通过ctDNA检测筛选出复发/进展高风险的患者，为其在临床进展前创造干预治疗的机会。

在一项具有里程碑意义的研究中发现，结肠直肠癌手术后几周的ctDNA分析可以准确预测残留病灶并最终复发的患者。NCCN结肠癌指南2021.V2版“可切除结肠癌辅助化疗”的讨论部分中新增了“Circulating Tumor DNA (ctDNA)”，指南中首次提出希望应用ctDNA检测技术能够提供预后和预测信息，以帮助II期和III期结肠癌患者的辅助治疗决策。同样，一些关键研究表明ctDNA中肿瘤特异性突变的术后检测可以预测乳腺癌、肺癌、食管癌等实体瘤中的残留病灶和肿瘤复发。在《非小细胞肺癌分子残留病灶专家共识》中，基于ctDNA的微小/分子残留病灶（MRD）的检测对评估治疗效果、警示复发风险和判断疾病预后等意义重大。

▲基于ctDNA检测指导结直肠癌的术后管理

▲MRD检测优于传统的临床或影像学方法鉴定出有疾病复发的患者

循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是指从肿瘤原发或转移灶上脱落下来，并释放到外周血液循环中的肿瘤细胞。

在血液中 CTC以单个或多个聚集成团的形式存在。CTC检测作为新兴的液体活检技术，具有取样方便、侵入性小、信息全面、成本低等优势，并被广泛认为是潜在的肿瘤生物标志物，已多次被纳入国内外权威指南共识中。

▲CTC临床应用专家共识汇总

针对血液中CTC检测流程包括：（1）CTC的分离和富集，（2）对CTC进行蛋白水平或者基因水平的分析，（3）再分析CTC的特性，给出治疗策略。由于外周血中CTC的数量稀少，以及随着肿瘤转移CTC亚型不断变化，所以对CTC捕获及鉴定技术的研究是关键环节。

▲CTC检测流程

近日，中华医学会检验医学分会分子诊断学组发布了《循环肿瘤细胞临床应用与实验室检测专家共识》（以下简称“共识”），标志循环肿瘤细胞（CTC）检测进入临床普及阶段，同时也有了系统规范的行业专家指导共识。共识明确了CTC检测的临床应用场景以及不同分子分型CTC检测的临床价值，CTC检测在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤中得到应用。

共识1：CTC计数可用于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肝癌等实体肿瘤的疗效评价和预后评估，应结合具体肿瘤类型和CTC检测方法选择合适的判断阈值；追踪手术前后或综合治疗过程中CTC的动态变化可为肿瘤疗效评价和预后评估提供实时监测信息。

共识2：CTC计数可提示肿瘤转移风险和辅助肿瘤分期，联合CTC计数和影像学、病理学、血清学特征参数有助于更准确地评估肿瘤状态和疾病进展；不建议单独以CTC计数作为肿瘤早期筛查和诊断的工具。

共识3：CTC分子分型可为全面评估肿瘤状态和肿瘤精准诊疗提供重要的实时信息；基于治疗靶标的CTC分型分析有助于提示药物疗效从而指导治疗决策，如ARV7（前列腺癌内分泌治疗）、HER2/EGFR/KRAS（靶向用药）等。

共识4：CTC-EMT（上皮-间质转化分型）分型的临床应用价值在多种肿瘤类型研究中得到证实，结合CTC计数和EMT分型及其动态变化可辅助肿瘤分期、复发风险评估及预后预测；针对肿瘤细胞干性和代谢特征的CTC功能分型有助于反映CTC的生物学转归和疾病的发展，是未来泛癌种CTC分子分型发展的前沿方向。

共识5：CTC有多种存在形式，包括单个细胞、CTC簇或CTC与其他血液成分（白细胞、血小板、巨噬细胞等）聚集成团，CTC细胞团检出率的提高有赖于检测方法的进一步优化；分析CTC的存在形式有助于揭示CTC与循环中血细胞、免疫细胞的相互作用，阐明CTC免疫逃逸和转移播散的机制，是CTC检测领域重要的探索方向。

共识6：CTC体外培养、单细胞测序等下游分析是CTC检测领域的前沿方向，也是精准医学时代CTC临床应用的重要趋势；未来CTC检测技术的进步应着重突破CTC单细胞测序的瓶颈问题，探索单细胞CTC高保真核酸扩增及文库构建等创新技术，以促进CTC单细胞分析的发展和应用。

外泌体是来源于肿瘤细胞脱落的囊泡，直径为30～150nm，携带肿瘤细胞的RNA、蛋白质、microRNA、DNA等多种成分，在血液、尿液、唾液、乳汁及脑脊液等多种体液中均有分布。外泌体在癌症的发生发展中发挥关键作用，包括免疫抑制、血管生成、细胞迁移和侵袭，更重要的是，携带肿瘤微环境的信息。外泌体可以被看作非侵入性早期癌症诊断和疗效评估的理想生物标志物。

▲外泌体发展历程

外泌体检测流程上可以分为两个步骤：第一步是对于外泌体进行提取，第二步是对外泌体进行分析以确定病灶。目前外泌体常见提取方法主要有以下几种：离心法、色谱法、过滤、基于聚合物的沉淀法、免疫分离法。外泌体分析方法主要有两种：1．蛋白水平的分析方法，包括Western-Blot、流式细胞仪等；2．基因水平的分析方法，包括PCR（主要是RT-PCR）、基因芯片、NGS等。

▲外泌体分离、分析与应用流程

《外泌体研究、转化和临床应用专家共识》指出，检测外泌体标志物，能够实时动态地反映患者的疾病状态，因此在疾病的早期筛查、无创诊断、疗效监测、辅助用药等领域有着广泛的应用前景。此外，作为药物载体的潜在形式，在肿瘤等疾病治疗中也展示出诱人的潜力。

现已在多种肿瘤中证实，基于外泌体miRNA以及外泌体蛋白分析均可作为肿瘤诊断的生物标志物。比如：外泌体蛋白可作为胰腺癌（PC）诊断的生物标志物。从癌前病变人群或胰腺癌患者血液中分离出的外泌体中含有一种膜结合蛋白-磷脂酰肌醇蛋白聚糖１（GPC1），GPC1可以作为早期监测胰腺癌的一种特异性的生物标志物。外泌体GPC1水平与肿瘤负荷和手术前后患者的生存率相关，因此，外泌体GPC1水平可以用来判断胰腺癌的分期。

▲外泌体检测常用的肿瘤标记物

外泌体可作为纳米载体来介导细胞间的信息传递，通过配体-受体介导的方式作用于受体细胞，向受体细胞转移功能蛋白、mRNA、miRNAs或转录因子等信息，这为肿瘤靶向治疗开辟了新的途径。相关研究表明可利用电穿孔法、化学转染法等方式把治疗性药物装载到外泌体中或将编码某蛋白质的基因转入到分泌外泌体的细胞中。例如，合成的miR159可通过靶向编码Wnt信号转录因子的转录因子７（TCF7）基因抑制乳腺癌细胞增殖。

多项研究表明外泌体miRNA可作为癌症化疗、靶向治疗、免疫治疗有效性的生物标记物。免疫治疗已成为晚期非小细胞肺癌患者的一个重要治疗选择，而现有的生物标志物不能有效的对患者免疫治疗反应进行分层。一项研究纳入EGFR/ALK阴性并进行抗PD-1/PD-L1免疫治疗的患者，通过分析血浆外泌体miRNA的表达，结果表明hsa-miR-320d、hsa-miR-320c和hsa-miR-320b的高表达可能与抗PD-1免疫治疗的不良响应相关。

近年来，外泌体在肿瘤复发监测方面也有一些新的进展。膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，大概有75%的患者为非浸润性膀胱癌（NMIBC），而NMIBC的特点是复发率超高。目前膀胱癌复发监测主要依赖于膀胱镜，因此需要开发无创的检测手段用于监测膀胱癌复发。一项研究通过分析训练集（104例膀胱癌患者、104例健康对照）与测试集（80例膀胱癌患者、80例健康对照）的尿液外泌体LncRNA，结果表明针对NMIBC患者，尿液外泌体MALAT1和PCAT-1可以作为NMIBC复发监控的标志物。

安龙基因针对实体瘤开发了多款液体活检检测产品，包括基于一代以及二代检测方法的ctDNA检测产品，基于免疫荧光原位杂交技术（iFISH）检测方法的CTC检测产品，可应用于正常人及病人的治疗前、中、后三个阶段，不仅为正常人群提供肿瘤早筛体检，还为肿瘤患者在辅助诊断、疗效实时监测、复发监测、用药指导和耐药机制探索、预后判断等方面提供全面的临床信息，提高患者获益可能性，助力临床个体化诊疗，延长患者生存期。