DNA在复制过程中可能整合错误的核苷酸，DNA错配修复（Mismatch repair，MMR）系统的功能是识别并纠正DNA复制过程出现的错误，确保复制过程的“保真性”。MMR根据其基因家族蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）表达模式被分为2类：错配修复缺陷（dMMR）和错配修复功能完整（pMMR）。其中，dMMR是造成微卫星不稳定（Microsatellite instability，MSI）的主要原因。

错配修复蛋白包括MutS和MutL两大家族，前者包括MSH2、MSH3和MSH6等，后者包括MLH1、MLH3、PMS1和PMS2。MSH2和MLH1分别与其同源错配修复蛋白组成异源二聚体而发挥作用。MSH2分别与MSH6、MSH3组成复合体MutSα、MutSβ。MLH1则分别与PMS2、PMS1或MLH3形成复合体MutLα、MutLβ或MutLγ。MutSα或MutSβ识别了错配碱基后，与DNA碱基结合，再与MutL结合，激活ATP酶，水解错配的碱基，同时激活核酸内切酶1，切除并修复错配的碱基。

DNA错配修复功能示意图

注：表突变（Epimutation）是指基因表达调控的表观遗传学异常，导致正常活性基因的转录抑制，或正常沉默基因的活化，但在累及基因中并不存在DNA序列的改变。组成性表突变（Constitutional epimutation）是指存在于个体的所有细胞、并构成疾病表型基础的表突变，但它未必是胚系水平的突变。

微卫星（Microsatellite，MS）是指细胞基因组中以少数几个核苷酸（多为1 ~ 6个）为单位串联重复的DNA序列，又称短串联重复（Short tandem repeat，STR）。然而，当发生dMMR时，微卫星出现的复制错误得不到纠正并不断累积，使得微卫星序列长度或碱基组成发生改变，称为微卫星不稳定性（Microsatellite instability，MSI），同时导致基因组呈现高突变表型。MSI根据程度被分为3类：微卫星高度不稳定性（MSI-high，MSI-H）、微卫星低度不稳定性（MSI-low，MSI-L）、微卫星稳定（Microsatellite stability, MSS）。

1993年，Jacobs等人在结直肠癌中首次发现MSI在肿瘤诊疗过程中的重大作用。随后，临床研究表明MSI-H在不同癌种中都有一定的发生率，例如已知MSI-H发生率较高的实体瘤包括子宫内膜癌（20% ~ 30%）、胃癌（15% ~ 20%）和结直肠癌（12% ~ 15%，其中Ⅳ期结直肠癌4% ~ 5%）等。目前，MSI在林奇综合征筛查、分子分型、预后及辅助治疗、免疫治疗等多方面具有重要的临床意义。NCCN、ESMO、CSCO等国内外权威癌症诊疗、筛查指南以及共识均推荐，对包括结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌在内的多种癌症患者进行MSI检测。

林奇综合征（Lynch syndrome，LS）又名遗传性非息肉性结直肠癌，为最常见的遗传易感性结直肠癌（遗传率可达50%），是一种常染色体显性遗传性肿瘤综合征。一般林奇综合征患者提升结直肠及其他多部位（包括子宫、卵巢、胃、小肠、胰腺、肝胆系统、上尿道、脑和皮肤等）罹患恶性肿瘤的风险，因此对综合征的筛查在临床上显得尤为重要。基于分子检测方法，林奇综合征主要是由于MMR基因（MLH1、MSH2、MSH6或PMS2）之一发生胚系致病性突变所致，或由EPCAM基因缺失导致MSH2不表达所致，其表现往往为dMMR和（或）MSI-H表型。

《遗传性结直肠癌临床诊治和家系管理中国专家共识（2018）》指出，在条件允许的情况下，所有结直肠癌（CRC）患者都要进行MMR蛋白/MSI检测，以进行林奇综合征的初筛。同时，对于经初筛确定的dMMR/MSI-H患者，再考虑林奇综合征相关基因的胚系突变检测，以明确诊断。值得注意的是，MMR蛋白/MSI检测作为林奇综合征的初筛手段，发生部分林奇患者的漏检也是不可避免的。MMR蛋白表达及MSI状态判定对Lynch综合征的检测敏感度分别为83％和77% ~ 89%，提示即使对所有CRC患者进行MMR或MSI普筛，也可能存在高达10%的漏诊率。

Lynch综合征筛查诊断流程

子宫内膜癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤，《2022.V1版子宫内膜癌NCCN指南》指出MMR蛋白/MSI检测是其分子分型的重要环节，有助于完善对子宫内膜癌肿瘤组织分型的大体病理学检查。MSI-H在子宫内膜癌中占比20% ~ 30%，该型子宫内膜癌具有突变频率高、拷贝数低的特点。MSI-H型的子宫内膜癌患者预后中等，并且该类型患者一般采用放疗或放疗联合化疗的方式进行辅助治疗，相对于靶向治疗，该类型的患者更适合免疫治疗。

胃癌在我国的发病率位居第三，死亡率也较高。MSI作为胃癌诊疗指南中Ⅰ级推荐检测的分子标志物，有助于胃癌分子分型，让患者得到合理的治疗。胃癌中MSI-H患者比例高达20%，MSI-H胃癌倾向于肠型胃癌，预后较好。临床研究报道，针对MSI-H/dMMR胃癌患者，与单纯手术相比，接受术前化疗+手术的预后不佳。总的来说，相较于MSI-H患者，MSI-L/MSS更能从新辅助化疗中获益，这也提示MSI/MMR状态可能帮助胃癌患者决定是否需要术前化疗。

MSI已经成为了结直肠癌患者中指南共识推荐检测的分子标志物之一，具有评估预后及辅助化疗等多重临床意义。首先，MSI可以作为II期CRC患者预后的分子标记：MSI-H预后好，对5-FU不敏感；MSI-L/MSS预后不良，5-FU疗效好。同时，MSI状态可以决策II期CRC患者是否需要采用辅助化疗：1）对于dMMR/MSI-H的低危II期患者，不需要采取辅助化疗，推荐观察；2）对于MSS/MSI-L的普危II期患者，推荐观察，或采用卡培他滨或5-FU/LV辅助治疗；3）对于MSS/MSI-L的高危II期患者，推荐CAPEOX或mFOLFOX联合化疗方案，单药方案为卡培他滨（首选）、5-FU/LV。

2021 CSCO结直肠癌诊疗指南

小肠腺癌起源于十二指肠、空肠、回肠。《2022.V1版小肠腺癌NCCN指南》指出，II期小肠腺癌（SBA）术后是否应接受辅助化疗以及应接受何种药物或方案进行治疗，需要综合考虑临床病理分期、高危因素以及MSI状态：1）MSI-H/dMMR的II期患者，术后采取观察；2）MSS/pMMR且无高危因素的IIA期患者，可行观察，或采用卡培他滨或5-FU/LV辅助治疗；3）MSS/pMMR的高危II期患者，采用FOLFOX、CAPEOX、5-FU/LV或卡培他滨治疗，亦可考虑观察，对于符合风险的II期十二指肠癌患者，如术后切缘阳性，可采用卡培他滨或5-FU灌注治疗。

2022.V1版小肠腺癌NCCN指南

2016年，欧洲临床肿瘤协会（ESMO）转移性结直肠癌共识指南提出，MSI检测对转移性结直肠癌患者免疫检查点抑制剂治疗具有强烈的预测价值。在一项纳入149例MSI-H或dMMR实体瘤患者的试验中，帕博利珠单抗（Pembrolizumab）治疗的总缓解率为39.6%，其中完全缓解率为7.4%，部分缓解率为32.2%；该研究中的结直肠癌、子宫内膜癌、胆管癌、胃癌或胃食管结合部腺癌、胰腺癌等癌症患者均取得了生存获益；以上结果表明，MSI检测结果与患者能否从免疫检查点抑制剂中受益紧密相关，同时不再局限于肿瘤来源。2017年，FDA批准帕博利珠单抗用于MSI-H/dMMR晚期实体瘤患者，这也使得MSI成为了泛癌种中炙手可热的分子标志物。目前，随着国内外免疫检查点抑制剂纳武利尤单抗、Dostarlimab和恩沃利单抗（Envafolimab）等陆续上市及适应症拓展，进一步提升了dMMR/MSI-H实体瘤患者从免疫治疗中获益的可能性。

各癌种接受帕博利珠单抗治疗的获益情况

MSI-H/dMMR实体瘤适应症的免疫检查抑制剂国内外获批情况

检测癌细胞中MSI的状态，既可直接检测MSI序列的变化来确定，也可依赖MMR蛋白的表达情况来判断。MSI检测一般通过分子水平的PCR检测技术及高通量测序技术（NGS）来实现，而MMR蛋白的表达情况由免疫组织化学法（IHC）检测获得。一定程度上，dMMR ≈ MSI-H；pMMR ≈ MSS + MSI-L。

IHC检测MMR蛋白表达情况来判断MSI的状态，主要集中在对4个常见MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的检测。上述MMR蛋白如任一发生缺失（缺失用“－”表示），则判定为dMMR；如4个蛋白均正常表达（正常用“＋”表示），则称为pMMR。针对dMMR患者，除了MLH1蛋白缺失且伴有BRAF突变和（或）MLH1甲基化外，其他情况需进一步检测MMR基因胚系+体系的突变检测。

MMR-IHC检测结果及提示意义

多重荧光PCR毛细管电泳法是检测MSI的“金标准”，通常检测正常组织和肿瘤组织中MSI位点，然后通过比较确定肿瘤样本中微卫星不稳定位点数量来判断肿瘤样本的MSI状态。国内专家共识推荐采用5 ~ 7个微卫星位点组合（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、MONO-27）进行MSI的检测。目前，Promega MSI分析系统的5个微卫星标记（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27）被视为PCR-MSI检测较为优异的选择。此外，最终MSI结果的判读一般遵循：2个或2个以上标记显示不稳定为MSI-H；有1个标记显示不稳定为MSI-L；所有位点都稳定为MSS。

二代测序技术NGS基于高通量测序平台，采用计算工具对肿瘤组织中多个MS位点进行检测。目前，ESMO精准医学工作组（ESMO Precision Medicine Working Group）推荐将NGS作为MSI的二线检测方法（second line testing）。研究显示，基于NGS的MSI检测结果与传统PCR方法比较的吻合度高达99%，与经病理医师双重确认的IHC检测结果吻合度为92.4%。

基于NGS平台的MSI算法

注：*代表与多重荧光PCR毛细管电泳比较

MMR与MSI二者检测结果的一致性较好，目前普遍认为采用任何一种检测作为MSI-H肿瘤的筛查方法均可接受。鉴于MMR与MSI各自检测方法学的不同，在特殊情况下具有互补性，故了解检测方法各自的优缺点有助于其检测结果指导临床的精准应用。

IHC检测MMR蛋白，可操作性强，且经济省时，可以具体反映功能缺失的错配修复蛋白信息。对于少数MSH6胚系突变病例的肿瘤由于错配修复系统的功能冗余作用可不表现为MSI，但免疫组织化学可检出蛋白表达缺失，因而可弥补MSI-PCR检测方法的局限性。既往研究结果表明，IHC-MMR与PCR-MSI检测结果吻合率可高达90%以上，但该结论是基于建立可靠、经认证的检测平台基础上。值得注意的是，IHC的判读对病理医师要求较高，且临床实践过程中也难免会出现蛋白表达结果错判的情况。

多重荧光PCR毛细管电泳法检测MSI，采用标准化的检测流程，结果的判读较简单，可以直接的反映肿瘤的MSI状态。对少数错义突变导致蛋白功能异常但并不影响蛋白翻译和抗原性时，MMR-IHC检测可误判为pMMR，而MSI-PCR检测正好可以弥补。基于过往的研究，MSI-PCR检测的假阳性低于MMR-IHC法，但其检测需要正常组织（癌旁组织）作为对照，费用相对较高，对肿瘤细胞的含量也有一定的需求，无法确定突变基因的具体信息。同时，MSI-H在实体瘤中普遍占比较低，对于多数实体瘤患者，单独进行 MSI 检测的成本-效益比过低。

NGS检测MSI的优势为通量高，能极大提高分子诊断效率，有利于降低样本量。NGS-MSI可覆盖的微卫星位点高达数十至上千个，远多于传统PCR检测方法的5 ~ 7个位点，有望增加非结直肠癌样本检测敏感度，且能同步检测肿瘤靶向用药相关基因突变以及TMB（大NGS panel）、MMR基因体系/胚系突变（胚系突变确诊Lynch综合征，体系突变为散发）等。NGS-MSI的普及局限于它相对较高的成本，其中也包括对其数据分析的技术要求，故一般不推荐NGS单独用于MSI检测。

MMR和MSI检测方法的比较

PCR-MSI与IHC-MMR两种方法的原理以及实验操作存在差异，这也客观说明两者的结果会出现不一致的情况。MSI与MMR检测结果不一致原因一直是整个检测领域激烈讨论的问题，下面内容就MSI与MMR不一致的两种情况及原因进行总结说明。

IHC检测针对的是MMR蛋白家族中常见的4个蛋白，它们中的某些蛋白发生缺失会有其他蛋白代偿其功能。其中，最典型的是MSH3蛋白代偿MSH6蛋白：MutSα（MSH2-MSH6二聚体）或MutSβ（MSH2-MSH3二聚体）均是错配识别蛋白，而MSH3蛋白不在IHC检测范围内，当MSH6蛋白表达缺失时，IHC检测结果为dMMR；但MSH3可以代偿MSH6蛋白功能，故MSI检测结果又为MSS-L/MSS。

采用PCR法检测MSI状态，MSI标记的选择对其结果会有一定的影响。例如，MSH6主要识别单碱基的错配，使用双核苷酸位点的MSI标记可能会发生MSH6缺失表达的漏检，故建议使用仅含单核苷酸位点的标记。换言之，当MSH6表达缺失时，IHC检测结果显示为dMMR；若使用双核苷酸位点的标记，MSI-PCR的检测结果可能会显示MSS-L/MSS。

腺瘤是结直肠癌的前驱病变表现，在林奇综合征患者中具有发病早和疾病进展快的特点。研究表明，在低级别腺瘤中，dMMR事件的发生比MSI-H事件的发生相对更早，换言之，IHC检测结果显示dMMR，但MSI检测结果却可能不会出现MSI-H。因此，低级别腺瘤的MMR/MSI状态可能与癌症组织中不一样，也正是肿瘤异质性导致了这种结果的差异。其次，在散发性结直肠癌中，MLH1启动子的甲基化或MLH1基因的致病性突变导致的异质性也是MLH1蛋白缺失（dMMR）且MSS的原因之一。

新辅助治疗前后的IHC-MMR蛋白检测结果也会出现差异。例如，研究显示新辅助放化疗后的直肠癌可能几乎完全丧失MSH6染色或仅有核仁染色，同时约30%的直肠癌出现PMS2染色减弱，这可能导致最终IHC-MMR蛋白检测结果为dMMR，而MSI状态却显示为MSS。

免疫组化法（IHC）仅涉及MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的检测，实际上，MMR蛋白包括以上4种但不限于它们。因此，当IHC的结果显示pMMR时，可能会有IHC未检测到或未识别的MMR基因发生突变引起MMR缺陷，此时MSI的结果会表现为MSI-H。

当编码MLH1、MSH2、MSH6、PMS2四个蛋白的基因发生错义突变时，MMR蛋白功能会出现异常但其抗原结构可能不会受到影响。这种情况下，IHC检测到MMR蛋白是正常表达的，即pMMR，但其实错配修复功能是异常的，这也就导致了MSI的检测结果显示为MSI-H。

通常，MMR系统的正常运行依靠许多系统外的其他蛋白调控，例如表观遗传组蛋白标记H3K36me3可以与MSH6直接作用招募复合体MutSα，进而调控MMR功能。然而，当系统缺乏H3K36三甲基转移酶SETD2时，MMR系统发生紊乱，IHC检测结果为pMMR，但MSI的状态仍会显示为MSI-H。

除了以上关乎MMR蛋白及MMR系统自身的缘由之外，机体的一些变异也可能成为MMR和MSI检测结果不一致的原因之一。目前，已有少量文章报道POLE基因核酸外切酶区域的突变也可以解释pMMR且MSI-H现象，但这种概率低，仅小于1%。

综合上述MSI与MMR检测结果不一致的各种情况，了解到这种结果差异来源于技术、机理及判读等多方面原因。为了提高阳性筛查率且让患者获得更大的临床效益，不管在LS的筛查、肿瘤患者治疗指导及免疫检查点抑制剂治疗前，都建议行MSI及MMR检测，联合两者的结果给出更好的临床决策。CAP最新指南指出，当出现MSI与MMR结果不一致时，应该对不一致的结果进行审查，以确保不一致的结果不是由于解释上的错误。《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》同时指出，如果遇到患者同时进行IHC-MMR蛋白表达和DNA分析（PCR或NGS法）MSI状态检测且检测结果不一致的情况，可考虑采用第3种方法（NGS或PCR法）进行验证（部分专家推荐）。

MSI检测结果关联着林奇综合征的筛查、肿瘤分子分型、预后及辅助治疗、泛癌种免疫疗效等临床受益内容。目前，NCCN/CSCO指南推荐MSI检测的瘤种有：结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、小肠腺癌、胰腺癌、前列腺癌、食管癌或胃食管交界肿瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝胆肿瘤、乳腺癌等。此外，针对需要进行林奇综合征筛查或寻求免疫治疗的实体瘤患者，也推荐进行MSI状态的检测。本公司基于多重荧光PCR毛细管电泳法和NGS法两种检测手段，开发并推出了一系列MSI检测套餐，主要包括MSI单检项目、安司康-139/168/269检测套餐、安择康-550/550 TMB/1028检测套餐，进一步评估了免疫及化疗药物的疗效，极大地提高了肿瘤患者临床获益的可能性。

安龙基因MSI检测项目及套餐